Técnicas

2 - Protocolo para obtenção de Trombina Autógena

Há alguns anos atrás (1999), publicamos um protocolo de obtenção de Plasma Rico em Plaquetas que tem sido usado por inúmeros colegas. O protocolo foi reproduzido com sucesso nos mais diversos pontos de nosso Pais, na Argentina, no Uruguai, no Chile, na Itália e recentemente foi provado e reproduzido pelo professor Paul Petrungaro nos EUA...

Mesmo assim, recebemos críticas de alguns colegas que afirmam que nosso protocolo não permite a obtenção de um PRP eficiente. Porém, mesmo lendo quase tudo o que se publica sobre PRP ( somos atualmente consultores da Medtronic no Brasil) ainda não encontramos nenhum outro protocolo publicado em nossa literatura de parte de nossos críticos.

Desta forma, seguindo em nossa pesquisa que busca sempre tornar mais fácil e eficiente a obtenção simplificada de P.R.P. chegamos a algumas modificações, já testadas por 6 anos, que permitem uma maior concentração de plaquetas por ml.

 Nosso protocolo Atualizado: 

O autor, através da experimentação de diversos diâmetros de centrífugas, utilizadas nas rotações preconizadas para a obtenção de “papa de plaquetas“ para uso em pacientes portadores de distúrbios de coagulação, logrou uma relação adequada à necessidade volumétrica de PRP para a utilização clínica. Desta maneira é possível reproduzir de maneira precisa o protocolo proposto utilizando uma simples centrífuga de laboratório biomédico de 8 x 15 ml ( ex: FANEN 260 mp de 8 x 15 ml)

O Plasma Rico em Plaquetas é obtido a partir do seguinte protocolo:

 1 – Através de punção venosa periférica, sangue venoso é colhido com o auxílio de tubos carregados de vácuo de 4,5 ml ( Vacuontainer) , contendo citrato de sódio. Colhemos normalmente 6 a 8 tubos totalizando aproximadamente 40ml de sangue ( os tubos nem sempre colhem 4,5ml cada)

 2 – Os tubos são centrifugados em uma centrifuga de 8 x 15 ml a 200g (gravidades) equivalente a 800 rpm  por 10 minutos.

3 – A porção celular (hemáceas) precipita na porção final do tubo e o plasma rico em plaquetas contendo leucócitos sobrenada . (Figura 3)

 4 – O PRP é pipetado diretamente dos tubos e acondicionado em um dois tubos. Pipetamos 1ml da “zona de névoa” e acrescentamos nestes tubos ( 0,5ml em cada tubo). Esta suspensão será utilizada juntamente com o PRP para a obtenção do coágulo, pois contem algumas hemáceas, os monócitos e plaquetas maiores.

Desta maneira podemos obter aproximadamente  um volume de 4,0 ml de PRP autógeno por cada tubo em um total de 8 ml. 

Em nosso protocolo anterior, utilizávamos todo este PRP obtido para a obtenção do gel. 

MODIFICAÇÃO DO PROTOCOLO: 

5 – Recolocamos os dois tubos na centrífuga ( em posições opostas) e centrifugamos por 10 minutos a 1.300 rpm. ( 400 gravidades)

Ao abrir a centrífuga e retirar os tubos iremos observar o “botão”de plaquetas que permanecerá no fundo de cada tubo sendo que, o plasma estará separado tomando o restante do tubo. 

6 – Retiramos agora, 2ml deste plasma de cada tubo deixando apenas 2ml e o botão plaquetário ao fundo. Desta maneira, diminuímos o volume de plasma e, portanto, concentramos mais o PRP. Se necessitarmos de  uma concentração ainda maior de plaquetas podemos retirar mais plasma ( 3ml) deixando a solução mais concentrada.

Agitando agora o tubo, você poderá observar o PRP em sua coloração normal. 

7 - No momento da utilização o PRP é mesclado ao enxerto e adicionado com a solução de trombina autógena e gluconato de cálcio para obtermos a coagulação. 

Temos trabalhado há 3 anos com trombina autógena, obtendo o mesmo resultado da trombina bovina e um coágulo mais consistente. 

Este protocolo é o que mais se aproxima do mecanismo de funcionamento das máquinas automáticas de PRP  tais como a SmartPrep ou a Magellan. Somos entretanto concordes de que as máquinas totalmente automáticas ( a única existente no mercado é a Magellan) obtém concentrações maiores de PRP que em nosso protocolo e de forma mais simplificada porém seu custo é bastante elevado para nossos padrões clínicos. 

O fato do PRP ser um preparado autólogo elimina as influências de transmissão de doenças ou reações imunogênicas que existe com preparados alogênicos ou xenogênicos. Por isso o PRP é preparado no ato da cirurgia, a possibilidade da rotulação errada de uma amostra (que pode ocorrer quando usamos um sistema laboratorial) é também eliminada. 

Esperando que esta nossa contribuição venha a aprimorar o trabalho dos colegas que utilizam o PRP em suas clínicas ou centros de pesquisas, ficamos inteiramente a disposição de todos para a discussão do assunto e, das críticas que certa e fatalmente geramos. 

2 - Centrifugar a 200g por 15 minutos ( junto com os demais tubos)

3 - Colher o sobrenadante e uma pequena porção da zona de névoa e passar para outro tubo.

4 - Adicionar  gluconato de cálcio a 10% em quantidade equivalente a 50% do PRP obtido ( ex. se você obteve 2 ml de PRP acrescente 1 ml de gluconato)

5 - Deixar em banho- maria ( 37º C)  por 15 minutos - ocorrerá uma geleificação parcial

6 - Agite fortemente o tubo para liquefazer ao máximo este gel.

7 - Neste gel você irá encontrar a trombina autógena além de outros fatores que disparam a coagulação.

Você pode adicionar toda esta mistura ao PRP para provocar a geleificação, ou , se preferir, poderá coar a parte sólida e usar somente a parte líquida.

Sabemos que o produto não é somente TROMBINA e também sabemos que podemos separá-la através de procedimentos especiais. Entretanto, o que buscamos é um catalisador autógeno para formar o Gel e isto é o que obtemos.

Como sabemos que o segredo para a separação celular é a força g  e que ela depende do raio de sua centrífuga colocamos em nosso site uma tabela com a qual você vai poder calcular a RPM necessária para atingir a força g ideal para a separação de plaquetas em sua centrífuga.